丝状真菌在工农业领域具有非常重要的应用，对其复杂细胞行为的研究和应用技术的开发均需要非常成熟的遗传编辑技术，尤其是多基因共编辑。目前，丝状真菌中多基因编辑还普遍依耐于使用不同标记基因或依耐于Cre/loxP、FLP/FRT等标记循环技术对目标基因进行逐个编辑，总体上在基因可编辑数量和操作时间上具有明显的不足。因此，开发一种能够在丝状真菌中普遍应用的高效多基因循环共编辑技术对于促进丝状真菌相关研究具有重要意义。

2021年3月22日，南京农业大学资源与环境科学学院土壤微生物与有机肥团队张瑞福教授课题组在Environmental Microbiology上在线发表题为“Overcoming diverse HRs and sgRNA competitive inhibition enhances Cas9-based cyclical multiple genes coediting in filamentous fungi”的研究论文。该研究成功建立了一套高效的丝状真菌多基因无痕循环共编辑技术。

该研究首先采用正反筛选标记ura3构建特异性敲除片段，使其能够通过两次独立的同源重组事件分别实现敲除片段的特异性整合与标记基因的无痕去除，从而实现无限制的基因循环编辑。然而，无痕循环编辑过程中存在同源重组多态性现象，循环编辑依赖的同源重组方式只占总同源重组事件的约1/6，且重组效率低下无法实现多基因共编辑。针对上述难题，该研究通过引入CRISPR-Cas9系统大大提高同源重组发生基数（90倍），并利用偏向剪切策略将多态性的同源重组限制为循环编辑依赖性的同源重组方式，从而实现多基因循环共编辑。然而，sgRNA介导的竞争性抑制现象却严重影响多基因共编辑效率和稳定性，该研究最终通过将标记基因只固定在拥有最低效率sgRNA的基因敲除片段上克服上述问题，最终实现能够单次进行3-5个基因的无痕共编辑，在短期内能够循环操作大量基因。

图1 sgRNA效率介导的多基因共编辑机制

图2 多基因无痕循环共编辑步骤示意图

缪有志博士为论文第一作者，张瑞福教授为通讯作者。沈其荣教授、刘东阳教授、张楠副教授、徐志辉副教授、荀卫兵副教授、冯海超博士以及博士研究生夏燕维等均参与了部分研究工作。本研究得到国家自然科学青年基金、江苏省青年基金和博士后面上基金的资助。

    论文连接：https://sfamjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/1462-2920.15477